酵母基因組編輯技術的建立及應用/當代科學理論與工程技術叢書
內容大鋼
本書共有7章，重點介紹了基於CRISPR-Cas9系統的無痕基因組編輯技術在漢遜酵母中的建立，應用該技術實現單位點基因組編輯、多位點基因組編輯，多元基因組編輯技術的推廣並應用該技術在酵母中實現高附加值化合物的合成。
作者介紹
王來友|責編:王睿
王來友，漢族，河南太康人，2019年6月畢業於中國科學院微生物研究所，博士。現于南陽理工學院生物與化學工程學院擔任講師，主講「分子生物學」「合成生物學」等課程。2019年以來，參與省級科研項目2項、省級教改項目1項，主持省級科研項目1項、教育廳科研項目1項、校級教改項目1項。在Biotechnology for Biofuels、ACS Synthetic Biology、ACS Omega等國際權威的SCI來源期刊發表論文多篇，在省級及以上期刊發表教改論文2篇。
目錄
1 緒論
1.1 酵母概述
1.1.1 酵母中乙?輔?A的代謝
1.1.2 酵母中的rDNA簇
1.2 CRISPR-Cas系統及其介導的基因組編輯技術
1.2.1 CRISPR-Cas系統概述
1.2.2 CRISPR-Cas系統的種類和特徵
1.2.3 CRISPR-Cas系統介導的基因組編輯技術
1.3 漢遜酵母及其遺傳操作的研究現狀
1.3.1 PCR產物介導的一步法基因敲除技術
1.3.2 Cre-loxP系統介導的無標記基因修飾系統
1.3.3 mazF基因介導的反篩系統
1.3.4 CRISPR-Cas9系統介導的基因組編輯技術
1.4 白藜蘆醇及其生物合成的研究現狀
1.5 人血清白蛋白和戊二胺概述
1.5.1 人血清白蛋白
1.5.2 戊二胺
1.6 生物柴油及其生物合成的研究現狀
1.7 研究目的、意義、內容和技術路線
1.7.1 研究目的及意義
1.7.2 研究內容
1.7.3 技術路線
2 基因組編輯技術在漢遜酵母中的建立
2.1 引言
2.2 實驗材料與設備
2.2.1 實驗材料
2.2.2 培養基及生物化學試劑的製備
2.2.3 儀器和設備
2.3 實驗方法
2.3.1 大腸桿菌感受態細胞的製備
2.3.2 大腸桿菌感受態細胞的化學轉化
2.3.3 大腸桿菌的質粒提取
2.3.4 大腸桿菌基因組DNA的提取
2.3.5 DNA的純化和回收
2.3.6 載體的構建
2.3.7 真菌基因組DNA的提取
2.3.8 漢遜酵母感受態細胞的製備
2.3.9 漢遜酵母感受態細胞的轉化
2.4 結果與分析
2.4.1 表達組成型Cas9蛋白線性化載體的獲得
2.4.2 轉錄gRNA線性化載體的獲得
2.4.3 漢遜酵母中CRISPR-Cas9系統介導的無痕基因編輯流程
3 漢遜酵母中的單位點基因組編輯
3.1 引言
3.2 實驗材料與設備
3.2.1 實驗材料
3.2.2 培養基及生物化學試劑的製備
3.2.3 儀器和設備
3.3 實驗方法
3.3.1 流式細胞儀檢測
3.3.2 其他實驗方法
3.4 結果與分析
3.4.1 OpLEU2基因的敲除
3.4.2 OpURA3基因的敲除
3.4.3 OpURA3基因的精確點突變
3.4.4 gfpmut3a基因在OpLEU2基因位點的整合
3.4.5 gfpmut3a基因在OpURA3基因位點的整合
3.4.6 gfpmut3a基因在OpHIS3基因位點的整合
4 酵母中的多位點基因組編輯
4.1 引言
4.2 實驗材料與設備
4.2.1 實驗材料
4.2.2 培養基及生物化學試劑的製備
4.2.3 儀器和設備
4.3 實驗方法
4.3.1 流式細胞儀檢測
4.3.2 實時熒光定量PCR檢測
4.3.3 HPLC檢測
4.3.4 其他實驗方法
4.4 結果與分析
4.4.1 OpLEU2、OpURA3和OpHIS3基因的同時敲除
4.4.2 CRISPR-Cas9系統在漢遜酵母中介導的多位點整合
4.4.3 CRISPR-Cas9系統在漢遜酵母中介導的多拷貝整合
4.4.4 融合表達盒在OprDNA位點的多拷貝整合
4.4.5 cadA基因在OprDNA處的多拷貝整合
4.4.6 HSA基因在OprDNA位點的多拷貝整合
4.4.7 多拷貝整合方法在釀酒酵母的建立
5 漢遜酵母中遊離質粒的構建及應用
5.1 引言
5.2 實驗材料與設備
5.2.1 實驗材料
5.2.2 培養基及生物化學試劑的製備
5.2.3 儀器和設備
5.3 實驗方法
5.4 結果與分析
5.4.1 漢遜酵母中遊離質粒的構建
5.4.2 gfpmut3a基因在遊離質粒上的表達
5.4.3 漢遜酵母中遊離質粒的消除
6 利用基因編輯技術在釀酒酵母中建立生物柴油合成途徑
6.1 引言
6.2 實驗材料與設備
6.2.1 實驗材料
6.2.2 培養基及生物化學試劑的製備
6.2.3 儀器和設備
6.3 實驗方法
6.3.1 釀酒酵母感受態細胞的製備
6.3.2 釀酒酵母感受態細胞的轉化
6.3.3 基因編輯
6.3.4 搖瓶發酵
6.3.5 SAM的提取與檢測
6.3.6 脂肪酸和脂肪酸甲酯的提取
6.3.7 遊離脂肪酸和生物柴油的檢測
6.4 結果與分析
6.4.1 外源基因在釀酒酵母中的功能驗證
6.4.2 增強遊離脂肪酸供給的效果評價
6.4.3 增強甲基供體SAM供給的效果評價
6.4.4 基因工程菌的發酵驗證
6.4.5 基因工程菌的發酵罐實驗
7 總結與展望
7.1 Cas9蛋白和gRNA在染色體上的表達
7.2 CRISPR-Cas9系統介導的基因組編輯技術的效率
7.3 CRISPR-Cas9系統介導的點突變的精確性
7.4 漢遜酵母中無痕多位點編輯技術的首次建立
7.5 多拷貝整合方法的實用性和應用性
7.6 結論
7.7 創新點
7.8 展望
參考文獻
附錄
附錄1 本書2?6章所使用的菌株、質粒和引物
附錄2 CRISPR-Cas9系統及白藜蘆醇生物合成相關基因序列及啟動子序列
附錄3 CRISRP-Cas9系統介導的基因組編輯技術在漢遜酵母中的編輯�
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